Processi biochimici del ciclo dell’azoto nel laghetto

Molte volte ho sentito affrontare la questione “laghetto anossico” o “laghetto tradizionale” in chiave dicotomica, in una divisione degli stessi tipicamente basata su una caratteristica presente in uno e assente nell’altro, quasi fossero oggetti di due mondi diversi ed incompatibili tra loro.processi biochimici

Chi era sostenitore di uno ne enfatizzava il disvalore dell’altro, basandosi unicamente sui risultati chimici dell’acqua che riscontrava nel proprio laghetto.

In realtà essi sono complementari se li proviamo a guardare nell’ottica della biochimica del ciclo dell’azoto.

processi biochimici: LA FASE NITRIFICANTE

Essa consiste in ossidoriduzioni dello stesso, in particolare in riduzioni assimilative o disassimilative di composti ossidati e in ossidazioni dovute a trasformazioni biologiche che coinvolgono vari stati di ossidazione dell’azoto.

Ricordiamo che nitrificazione e denitrificazione obbediscono alle esigenze energetiche delle cellule.

Partiamo quindi, nel nostro viaggio all’interno della biochimica del laghetto, dal processo di ammonificazione, ovvero dalla degradazione delle proteine assunte degli animali (il cibo che forniamo alle nostre koi) e dalla sostanza organica azotata proveniente da organismi morti (siano essi animali o vegetali).

La degradazione delle proteine e di altri composti organici azotati è il risultato del metabolismo di un’ampia varietà di batteri ammonizzanti presenti comunemente nei sedimenti in ambiente di acqua dolce e nel tratto intestinale degli animali.
Fra i batteri più attivi vi sono alcuni clostridi, che costituiscono la normale flora batterica del tratto gastrointestinale degli animali e dell’uomo.

Di qualsiasi genere comunque siano essi sono batteri chemioorganotrofi, ovvero che traggono energia, tramite processi di ossidoriduzione, da molecole organiche.

Se l’ossidante utilizzato è ossigeno gassoso (O₂) si parla di respirazione aerobia che viene utilizzata da organismi che vivono a contatto con acque ossigenate; se invece l’ossidante è un composto inorganico diverso dall’ossigeno, per esempio un nitrato, si parla di respirazione anaerobia.

Questo tipo di respirazione è limitata ad un ristretto numero di batteri, come i batteri denitrificanti, ed è particolarmente attiva in ambienti acquatici poveri o privi di ossigeno. L’ossidoriduzione anaerobia di molecole organiche viene definita fermentazione.

Prima tappa del processo di ammonificazione è l’idrolisi delle proteine ad amminoacidi, che avviene ad opera di enzimi proteolitici secreti dai batteri; gli amminoacidi vengono poi deamminati per produrre ammoniaca e, penetrando all’interno delle cellule dei batteri stessi, vengono utilizzati in gran parte come sorgente di energia.

La perdita di NH₃ da parte degli amminoacidi avviene attraverso due processi:
• La deamminazione ossidativa (per il glutammato o l’alanina) chiamata così perché richiede l’intervento di un agente ossidante come il coenzima NAD (nicotinammide adenina dinucleotide) che è una biomolecola il cui ruolo biologico consiste nel trasferire gli elettroni, quindi nel permettere le ossidoriduzioni o come il NADP che detiene la stessa struttura di base con l’aggiunta di un gruppo fosfato.
• La transamminazione (la maggior parte degli amminoacidi) che consiste nella degradazione dell’amminoacido con trasferimento enzimatico del gruppo amminico dall’amminoacido al carbonio chetonico del chetoacido corrispondente.

Questo poi, con opportune reazioni, entra nel ciclo di Krebs.

Il ciclo di Krebs (anche detto ciclo degli acidi tricarbossilici o ciclo dell’acido citrico) è un ciclo metabolico di importanza fondamentale in tutte le cellule che utilizzano ossigeno nel processo della respirazione cellulare.

L’ammoniaca, così formatasi per tali processi di amminazione, essendo altamente tossica soprattutto per il tessuto nervoso, non si accumula nell’organismo ma viene utilizzata in due modi alternativi: o viene usata, con l’intervento delle transamminasi, per la sintesi di amminoacidi secondo un percorso inverso a quello descritto, oppure viene escreta in varie forme dagli organismi.

Nelle Koi questo rifiuto azotato, essendo esse animali ammoniotelici, viene diluita in grandi quantità di acqua che i pesci ossei di acqua dolce assorbono continuamente dall’ambiente per osmosi ed escreta dall’organismo.

Comunque da essa derivi è nota la tossicità per tutti gli organismi viventi.

Nell’acqua l’azoto ammoniacale può presentarsi, in base al pH, sotto forma di ammoniaca NH₃ o sotto forma diione ammonio NH₄⁺.

Vale la pena ricordare che mentre a pH molto alcalino l’azoto è presente nella forma indissociata NH₃ , fortemente tossica, a pH 7.5 quasi tutto l’azoto ammoniacale è presente come ione ammonio NH₄⁺, forma assai meno tossica.

Formatasi così la base ammoniacale si passa ad un’altra fase del ciclo dell’azoto: la nitrificazione. Essa è il processo di ossidazione di composti ridotti dell’azoto.

E’ un processo strettamente aerobico, attuato da due gruppi di batteri nitrificanti presenti nelle acque; entrambi i gruppi sono chemiosintetici ed autotrofi obbligati poiché usano direttamente CO₂ come sorgente di carbonio, mentre le sostanze organiche sono per loro generalmente tossiche.

I batteri nitrificanti si dividono in due gruppi: un gruppo ossida NH₃ a NO₂^– passando per l’intermedioidrossilammina NH₂OH (batteri nitrosi, tra i quali quelli dei generi Nitrosomonas e Nitrosocystis), un altro ossida NO₂^– a NO₃^– (batteri nitrici tra i quali quelli dei generi Nitrobacter e Nitrococcus).

Nelle due tappe dell’ossidazione viene prodotto ATP (Adenosina trifosfato) dalla quale i batteri ricavano energia sufficiente per fissare CO₂ e per la sintesi degli altri composti organici.

Vediamo questi processi dal punto di vista biochimico: L’ammoniaca, come ione ammonio, viene ossidata a nitrito, con trasferimento di 6 elettroni:

NH₄⁺ + 3/2 O₂ –> 2 H⁺ + H₂O + NO₂^– (E = – 66,5 kcal/mole)

Il processo avviene in due tappe: La prima fase è dovuta a una monossigenasi che, usando O₂ come ossidante, inserisce un O in NH₃:    NH₄⁺ + 1/2 O₂ –> NH₂OH + H⁺

L’idrossilammina viene poi ossidata dall’idrossilamminadeidrogenasi, un enzima citoplasmatico complesso: NH₂OH + O₂ –> H⁺ + H₂O + NO₂^–

L’ossidazione del nitrito a nitrato NO₃, catalizzata dall’enzima nitritoossidasi, completa il processo della nitrificazione: NO₂^– + 1/2 O₂ –> NO₃^–   (E = – 17,5 kcal/mole)

A questo punto, convenzionalmente, terminano i processi che avvengono nei laghetti che sfruttano il sistema di filtrazione che io definisco “tradizionale” ovvero quello il cui prodotto finale è sostanzialmente l’accumulo di nitrato nell’acqua.

Nitrato che deve essere poi eliminato attraverso cambi d’acqua o reso disponibile alle piante per il loro metabolismo vegetale.

processi biochimici: LA COMPONENTE ANOSSICA

A questo punto analizziamo quali altri processi biochimici continuano nel nostro laghetto, specialmente se alla componente nitrificante classica (presente in ogni caso nel pond) abbiamo volutamente aggiunto una “componente anossica”.

I processi metabolici interessanti i composti nitritici sono sostanzialmente due: quello determinato dalla vegetazione e quello indotto dalla nostra filtrazione anossica.

Partiamo dal primo.

Nella maggior parte dei casi la pianta assimila azoto tramite l’ausilio di batteri i quali, formano dei noduli sulla radice, in maniera particolare in prossimità dei peli radicali.

In questi noduli vengono create delle condizioni anaerobiche le quali permettono agli enzimi deputati alla fissazione dell’azoto di praticare le loro funzioni.

Le associazioni simbiotiche in questo caso vengono chiamate “rizobi”, ossia associazione tra radice e batteri.

I batteri elaborano l’acido beta-indolacetico che provoca un caratteristico incurvamento ad uncino del pelo radicale. A questo punto i rizobi, se appartengono al ceppo adatto, penetrano nella radice attraverso i peli; quindi si moltiplicano velocemente e si allineano lungo l’asse del pelo stesso; qui i batteri vengono racchiusi in un tubo di cellulosa e pectina prodotti dalla cellula vegetale.

Il tubo porta l’infezione nelle cellule interne parenchimatiche, dove i batteri si trasformano in forme rigonfie definite batteroidi; le cellule reagiscono all’invasione moltiplicandosi e formando quel nodulo che chiamiamotubercolo radicale.

Il processo biochimico che questi batteri azoto-fissatori compiono è denominato organicazione dell’azoto, detto anche riduzione assimilativa del nitrato, che consiste nell’utilizzo a livello cellulare di azoto inorganico per la sintesi degli amminoacidi e di altre molecole organiche.

In questo processo l’ossidoriduzione del nitrato avviene in due stadi distinti: nel primo il nitrato è ridotto a nitrito, nel secondo il nitrito ad ammoniaca.

La riduzione del nitrato a nitrito avviene con il trasferimento di due elettroni: HNO₃ + 2e + 2H⁺ –> HNO₂ + H₂O

Tale reazione è catalizzata dall’enzima nitratoriduttasi assimilativa.

La nitratoriduttasi è una proteina che contiene FAD (flavin adenin dinucleotide) e molibdeno; il cofattore della nitratoriduttasi, Mo, è un microelemento indispensabile: in sua carenza non è possibile utilizzare il nitrato.

Donatori di elettroni per la riduzione del nitrato a nitrito sono NADH e NADPH, la nitratoriduttasi catalizza il trasferimento degli elettroni dai donatori al nitrato.processi biochimici processi biochimici

La parte che contiene FAD si chiama diaforasi, quella con Mo, parte terminale, al centro un citocromo. La diaforasi ha un sito attivo per NADPH, la parte terminale un sito per lo ione nitrato; FAD, citocromo e Mo costituiscono una catena di trasporto di elettroni che vanno da NADPH al nitrato per la riduzione.

La riduzione del nitrito ad ammoniaca mette in gioco sei elettroni: HNO₂ + 6e + H⁺ –> NH₃ + H₂O

In questo caso la proteina nitritoriduttasi può essere diversa in organismi diversi.

Nel caso dei batteri contiene FAD e Fe, il ferro fa parte di un componente eminico dell’enzima detto siroeme, che utilizza, come donatori di elettroni, piridin-nucleotidi ridotti.

Nel caso invece delle piante superiori la nitritoriduttasi contiene pure il siroeme ma, invece che FAD, un centro di reazione ferro-zolfo Fe-S; in tal caso, come donatore di elettroni viene utilizzata ferridossina ridotta.

Mediante il centro di reazione Fe-S e il siroeme avviene il trasferimento di elettroni per la riduzione del nitrito.

Esiste un sistema di controllo della riduzione assimilativa del nitrato, attuato mediante meccanismi di repressione: la riduzione viene, in particolare, inibita dall’ammonio.

La regolazione dosa la velocità di riduzione sulla base di esigenze metaboliche; inoltre impedisce l’accumulo eccessivo di ioni ammonio che risulterebbero tossici ed evita il processo di riduzione dei nitrati che è assai dispendioso da un punto di vista energetico.

L’ammonio reprime la nitratoriduttasi e ne arresta la sintesi; inoltre ne inibisce anche l’attività.

I due meccanismi di regolazione, la repressione e l‘inibizione, controllano la riduzione del nitrato in funzione delle esigenze della cellula; lo ione NH₃⁺ entra nel metabolismo soprattutto attraverso composti comeglutammina, acido glutammico e carbamil fosfato.
Una reazione molto importante di assimilazione dell’azoto, catalizzata dalla glutammina sintetasi che si trova in tutte le cellule umane, vegetali o batteriche, consiste nelle formazione della glutammina, che segue la formazione dell’acido glutammico.

Si ha successivamente il trasferimento riduttivo dell’azoto ammidico dalla glutammina al cheto-gruppo dell’acido 2-chetoglutarico.

Delle due molecole di acido glutammico una viene reimpiegata per formare glutammina ed incorporare così una nuova molecola di ammoniaca, l’altra invece verrà utilizzata dalla cellula per la sintesi degli altri costituenti azotati.

Per la sintesi di questi viene impiegato o l’azoto amminico del glutammato (mediante reazioni di transamminazione), come nella sintesi dell’alanina e nella sintesi dell’acido aspartico oppure viene impiegato il gruppo ammidico della glutammina come nella sintesi del triptofano e dell’AMP, adenosin mono fosfato.

Tutte queste vie metaboliche sono regolate tramite inibizione da prodotto finale.

Il secondo tipo di processo anaerobio che avviene all’interno del nostro laghetto a componente anossica, e che viene fortemente indotto dai cesti cenosici viene definito riduzione disassimilativa dei composti ossidati dell’azoto.

Sappiamo per certo che i nostri cesti favoriscono la colonizzazione di batteri aerobici facoltativi in grado di operare la respirazione anaerobia dei nitrati, usando cioè il nitrato, al posto dell’ossigeno come accettatore degli elettroni liberati durante il processo respiratorio.processi biochimici

Sono denitrificanti alcune specie batteriche dei generi Pseudomonas, Thiobacillus, Paracoccus e Naisseria; alcuni batteri sono capaci di portare a compimento per intero la denitrificazione, mentre altri soltanto stadi del meccanismo.

I batteri denitrificanti possiedono un’unica catena respiratoria che normalmente trasporta gli elettroni verso l’ossigeno. Collegati alla catena respiratoria, a livello di citocromi, questi batteri possiedono enzimi speciali, lanitratoriduttasi e la nitritoriduttasi che, in assenza di ossigeno, permettono agli elettroni di fluire verso il nitrato o il nitrito.

Sono enzimi adattativi che si formano nella membrana cellulare solo in condizioni di anaerobiosi, infatti in presenza di ossigeno la sintesi delle riduttasi viene repressa.

Il trasporto di elettroni lungo la catena respiratoria è accoppiato a processi di fosforilazione per produrre ATP e ricavare così energia come sopra descritto.

Nella denitrificazione, come nella respirazione aerobia, si ha completa ossidazione del substrato organico a CO₂ e H₂O, e la variazione di energia libera è quasi pari a quella che si ha nella respirazione aerobia, che è di -686 Kcal/mole di glucosio.

Le tappe del processo di denitrificazione sono diverse; esso avviene secondo diverse reazioni in cui il prodotto finale è N₂ e intermedi NO₂^– e N₂O.

5 C₆H₁₂O₆ + 24 NO₃^– –> 30 CO₂ + 24 OH^– + 18 H₂O + 12 N₂

(E = – 3018 kcal/mole)

C₆H₁₂O₆ + 6 NO₃^–– –> 6 CO₂ + 6 OH^– + 3 H₂O + 3 N₂O

(E = – 508 kcal/mole)

C₆H₁₂O₆ + 12 NO₃^– –> 6 CO₂ + 6 H₂O + 12 NO₂^–

(E = – 496 kcal/mole) poiché i prodotti gassosi vengono dispersi nell’atmosfera, la denitrificazione permette così la chiusura completa del ciclo dell’azoto.processi biochimici processi biochimici

Quanto sopra descritto, dalla formazione di azoto ammoniacale, al suo utilizzo da parte delle piante fino alla gassificazione dello stesso, è stato predisposto dalla più grande mente mai esistita: la natura, che ripresenta tutti i processi di ammonificazione – nitrificazione – denitrificazione – azoto gassoso in un circolo infinito in cui i componenti stessi del circolo si sovrappongono in una totale necessità di uni e degli altri.

E’ erroneo, a mio parere, rincorrere quindi la dicotomia filtro tradizionale Vs filtro anossico in quanto la biochimica del laghetto dimostra inequivocabilmente che il secondo completa il primo, senza il quale, neanche il secondo potrebbe esistere.

Merito del Dr. Novak avere trovato il substrato ideale atto a sostenere la componente anossica del ciclo dell’azoto; stesso merito di chi ha innovato i filtri tradizionali che sostengono la parte nitrificante del sistema.

La sfida per il futuro sarà, non quella di provare una incompatibilità dei due sistemi, ma ricercare la perfetta calibrazione tra i fattori nitrificanti e denitrificanti che ne esalti le performance di entrambi in termini di velocità e carico organico da smaltire.

E’ indubbio che le variabili da considerare sono molte e di ogni tipo.Pe esempio:Quale è il rapporto “aureo” tra superfice nitrificante e superfice denitrificante (considerando altresì che le temperatura di attivazione sono diverse tra i due tipi di batteri) ?

Considerando che nei i nostri pond funzionano ossigenatori supplementari, quale è il BOD (Biochemical Oxygen Demand), ovvero la quantità di consumo dell’ossigeno da parte dei batteri, al netto del consumo delle KOI, ottimale dell’acqua all’entrata nella componente anossica?

È possibile che un’alta concentrazione di O2 disciolto favorisca la componente nitrificante dei cesti cenosici a scapito della sintesi di riduttasi?

Queste sono solo le prime due domande che mi nascono spontanee da una visione globale dell’attività biochimica nel laghetto. Sono sicuro che a voi ne verranno altre……..

_{Bibliografia: studi del Prof. Gianni Michelon, professore associato di Chimica Generale – Università Cà Foscari Venezia}